赤子爱胜蚓核酸酶样蛋白的一级结构特征

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.15.016

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (15): 2390-2396.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.15.016

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赤子爱胜蚓核酸酶样蛋白的一级结构特征

于保锋^1，2，刘志贞^1，2，张悦红^1，2，解军^1，2，程牛亮^1，2，王建华³，牛勃^1，3

山西医科大学，¹基础医学院生物化学与分子生物学教研室，²细胞生理学省部共建教育部重点实验室，山西省太原市 030001；³首都儿科研究所生物技术研究室，北京市 100020

出版日期:2014-04-09 发布日期:2014-04-09
通讯作者: 牛勃，博士，教授，山西医科大学生物化学与分子生物学教研室，山西省太原市 030001
作者简介:于保锋，男，1977年生，山西省阳城县人，汉族，2006年山西医科大学毕业，博士，副教授，主要从事生物化学与分子生物学专业的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(30472251)；山西省自然科学基金青年科技研究基金(2010021035-2)；山西省归国留学人员基金(2010-52)

Primary structure of nuclease-like proteins from Eisenia foetida

Yu Bao-feng ^{1, 2}, Liu Zhi-zhen^{1, 2}, Zhang Yue-hong^{1, 2}, Xie Jun^{1, 2}, Cheng Niu-liang ^{1, 2}, Wang Jian-hua³, Niu Bo ^{1, 3}

¹Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China; ²Key Laboratory of Cellular Physiology by Shanxi Province and State Ministry of Education, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China; ³Department of Biotechnology, Capital Institute of Pediatrics, Beijing 100020, China

Online:2014-04-09 Published:2014-04-09
Contact: Niu Bo, M.D., Professor, Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China; Department of Biotechnology, Capital Institute of Pediatrics, Beijing 100020, China
About author:Yu Bao-feng, M.D., Associate professor, Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China; Key Laboratory of Cellular Physiology by Shanxi Province and State Ministry of Education, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 30472251; Youth Research Funds by the Natural Science Foundation of Shanxi Province, No. 2010021035-2; Shanxi Province Foundation for the Returned Overseas Scholars, No. 2010-52

摘要/Abstract

摘要：

背景：前期研究从赤子爱胜蚓组织中获得一组核酸酶样蛋白，对该组核酸酶样蛋白的一级结构进行研究，有利于揭示其结构的基本性质，为进一步结构与功能的研究奠定基础。
目的：对核酸酶样蛋白EWD1和EWD2进行一级结构的测定。
方法：采用Edman降解法测定EWD1和EWD2的N末端氨基酸序列，采用酸水解法测定其氨基酸组成，LC-MS/MS测定蛋白质内部分氨基酸的序列，MALDI-TOF-MS测定蛋白的含糖量和二硫键数目。
结果与结论：核酸酶样蛋白EWD1和EWD2的氨基酸组成中，天冬氨酸和天冬酰胺之和的含量最高，都达到近10%，疏水氨基酸亮氨酸的含量也较高，半胱氨酸含量较少，氨基酸组成比较显示，该2种酶与其它核酸酶较相似。Edman降解法测定，EWD1蛋白大亚基的N末端6个氨基酸序列为：D、E、W、V、Y、P，EWD2蛋白的N末端9个氨基酸序列为：L、L、G、P、Y、K、P、K、C；串，联质谱的结果提示2种核酸酶为新蛋白；MALDI-TOF-MS法显示1号核酸酶中含有8个半胱氨酸，形成4对二硫键，2号核酸酶中有6个半胱氨酸，形成3对二硫键。EWD1，2均为糖蛋白，EWD1中的含糖量为17.3%，EWD2蛋白中的含糖量为15.6%。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 赤子爱胜蚓, 核酸酶样蛋白, 一级结构, 质谱, 二硫键, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: A group of nuclease-like proteins were previously purified from Eisenia foetida tissues, exploring primary structures of these proteins will help to uncover basic structure characteristics of them and provide foundations for the study addressing the relationship of their structures and functions.
OBJECTIVE: To explore primary structures of nuclease-like proteins EWD1 and EWD2.
METHODS: Edman degradation method was used to sequence the N-terminal amino acids of EWD1 and EWD2, acid hydrolisis method was used to analyze amino acid compositions of EWD1 and EWD2, LC-MS/MS was used to analyze some peptide sequences within the proteins, and MALDI-TOF-MS was used to calculate the number of the disulfide bonds and the contents of polysaccharides.
RESULTS AND CONCLUSION: Among the amino acid compositions in EWD1 and EWD2, the sum contents of aspartate and asparagines were the highest (all nearly 10%), the contents of hydrophobic amino acids were also high, and the contents of cysteine was low. The EWD1 and EWD2 had similar amino acid compositions with other nucleases. Edman degradation results showed that, the N-terminal sequences of the large subunit of EWD1 were in turn as follows: D, E, W, V, Y, P; the N-terminal sequences of EWD2 were as follows: L, L, G, P, Y, K, P, K, C. The results of LC-MS/MS indicated the two proteins were novel proteins; MALDI-TOF-MS results showed that 8 cysteine residues formed 4 disulfide bonds in EWD1, 6 cysteine residues formed 3 disulfide bonds in EWD2. EWD1 and EWD2 were all glycoproteins, the content of polysaccharides was 17.3% in EWD1 and 15.6% in EWD2.

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Key words: oligochaeta, endonucleases, exonucleases, protein, amino acid sequence

中图分类号:

R318

于保锋，刘志贞，张悦红，解军，程牛亮，王建华，牛勃. 赤子爱胜蚓核酸酶样蛋白的一级结构特征[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(15): 2390-2396.

Yu Bao-feng, Liu Zhi-zhen, Zhang Yue-hong, Xie Jun, Cheng Niu-liang, Wang Jian-hua, Niu Bo. Primary structure of nuclease-like proteins from Eisenia foetida[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(15): 2390-2396.

图/表（结果） 7

参考文献

引言

随着对蚯蚓药用价值及药用活性成分的深入研究，发现蚯蚓体内含有丰富的药用蛋白质活性成分。国内外发现并分离纯化出多种蚯蚓组织有效成分，主要有蚯蚓溶栓酶、蚓激酶、胆碱酯酶、过氧化氢酶等^[1-2] 。本课题组前期从赤子爱胜蚓组织中分离纯化得到一组核酸酶样蛋白^[3] ，该类核酸酶样蛋白的的发现和研究揭示了可能还未被充分认识的蚯蚓组织中存在的一种消化和抵抗微生物的生物机制。事实上，关于核酸酶抗微生物的机制并不是蚯蚓所独有，它可能是一种被人们忽略了的但却又是一种在生物体内广泛存在的、能彻底杀灭微生物的机制，在防止外源性基因的侵犯、利用微生物作为食物的消化和吸收等生命过程中发挥着主要作用。很多低等动物，如苍蝇等均可以吞食大量的微生物而自身并不染病^[4-5] 。
目前用基因工程方法生产蚓激酶的研究主要集中在大肠杆菌表达系统和哺乳动物细胞表达系统。已有多位学者尝试在大肠杆菌系统中表达蚓激酶基因，但产物多为包涵体且复性困难，收率很低^[6-8] ；采用融合表达虽可获得具有生物活性的酶蛋白，但产量低，且必须设法去除fusion tag部分。哺乳动物表达系统虽能对目的产物进行修饰，但蚓激酶在其中或者对细胞存在毒性作用，或者只是瞬时表达，且哺乳动物细胞培养成本很高。值得注意的是，在高等动物的胃肠道同样存在着种类丰富、活性强大的核酸酶类，而这些酶显然不只是为了消化吸收功能而存在的，因为体内的核酸代谢并不依赖由胃肠道吸收而提供核苷酸原料，而主要靠细胞内自身合成^[9-10] 。更重要的事实是，体内固有免疫系统的免疫细胞完成吞食、消灭外源病毒的功能也是依靠一系列水解酶来完成的。因此，这个发现提示，生物体内广泛存在着一种可能被忽视了的、但却是十分有效的、能够彻底杀灭病毒的独特机制，有必要进一步深入研究核酸酶在体内的生物学意义和作用机制。
蚯蚓脱氧核糖核酸酶属于蚯蚓固有免疫的一个很重要的元素，脱氧核糖核酸酶与其他免疫分子协同或独立的在降解内外源废弃细胞及微生物的遗传物质上发挥了不可替代的作用^[11-12] 。本课题主要对前期纯化的赤子爱胜蚓核酸酶样蛋白EWD1和EWD2的一级结构进行研究，为进一步的结构和功能研究奠定基础。

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材料方法

设计：蛋白质结构研究。

时间及地点：于2010年10月至2013年8月在山西医科大学生物化学和分子生物学实验室完成。

材料：EWD1，EWD 2蛋白样品，本室保存，冻存于-80 ℃。

方法：

EWD1和EWD 2蛋白样品的氨基酸组成分析^[13-14]：色谱条件色谱柱：Phenomenex prodigy ODS 100A (4.6 mm× 25 cm，5 μm)；流动相：A为0.1 mol/L醋酸钠 (pH 6.5)-乙腈(93+7)，B为水-乙腈(1+4)。检测波长 254 nm；流速1 mL/min；柱温40 ℃。样品的水解：取PTH1-34原液200 L(质量浓度约1 g/L)置已标记的石英小管中，放入反应瓶，真空干燥。往反应瓶中加入600 μL含1%苯酚的6 mol/L盐酸溶液，抽真空并用氮气置换空气 3次。将反应瓶置105 ℃水解24 h后冷置室温，放入另一干燥反应瓶中，真空干燥。用前往石英小管中加入100 μL 0.1 mol/L盐酸溶液溶解。衍生化反应：精密量取氨基酸对照品溶液及水解后的供试品溶液各100 μL置1 mL离心管中，分别精密加入内标溶液10 μL，加入1 mol/L三乙胺乙腈溶液和0.1 mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液各50 μL，混匀，室温放置1 h，加入正己烷200 μL，振荡萃取后静置10 min，吸取下层溶液，用0.45 μm滤膜过滤。测定方法：取衍生化后的氨基酸对照品溶液和供试品溶液各10 μL进样分析，按内标法以峰面积计算样品水解液中各种氨基酸的含量(摩尔数)，以测得的Val，Ile，Leu，Lys摩尔数总和除以12(这4种氨基酸的理论摩尔数总和)作为1，计算样品中各种氨基酸的相对摩尔比例。

EWD1和EWD2蛋白样品的N末端氨基酸序列分析^[¹⁵^]：N-末端测序按Edman降解法，从PVDF(聚偏二氟乙烯)膜上，切取目的蛋白斑点，在Procise 491型(Applied Biosystems)蛋白测序仪上对转印在膜上的蛋白样品进行N-末端氨基酸序列测定。将每个循环切割下来的氨基酸于PTH-氨基酸进行比较，并与前后循环的氨基酸进行比较，确定N-末端氨基酸序列。以上工作可由微处理机自动完成，但需要进行人工确认。

胶内酶切(in-gel digestion)及质谱分析(LC-MS/MS)^[16]：切胶、脱色、胶粒脱水、真空离心干燥、DTT还原、烷基化、再将胶粒脱水、重泡胀胶粒、胶粒脱水、真空离心干燥、Trypsin 酶解、抽提肽段、真空离心干燥、将EP管中加入18 μL 5% ACN / 0.1% Formic acid，Vortex，吹打数次，充分溶解附着在管底和管壁的肽，15 000 r/min离心 15 min，用10 μL枪尖小心吸取上清，置于insert中，进行LC-MS/MS分析。

EWD1和EWD2蛋白样品中二硫键数目的测定^[17-18]：自由巯基数：自由巯基数可通过测定烷基化前后肽的分子质量差异来计算得到。测定供试品的分子质量M0，这可以用质谱得到，将供试品烷基化，测定烷基化后的产物的分子质量M1，则=MA×自由巯基数+M0，因此，自由巯基数=(M1-M0)/MA，其中，MA为烷基化试剂的分子质量，MA=105。本方法中，巯基烷基化试剂为4-乙烯基吡啶(4-VP)，属于亲核加成型烷基化试剂，其活泼基团乙烯基与巯基结合为加成产物，从而，自由巯基数= (M1-M0)/105。

半胱氨酸数和二硫键数：将供试品中的可能的二硫键全部还原，并将原有自由巯基和新产生的巯基烷基化，再测定还原和烷基化后产物的分子质量，比较前后分子质量的变化，根据上述类似原理可得到半胱氨酸数和二硫键数的计算公式：

半胱氨酸数=(M2-M1)/105，其中M2为还原并烷基化后的分子质量，二硫键数=(半胱氨酸数-自由巯基数)/2。

EWD1和EWD2蛋白样品N-糖含量的测定(MALDI-TOF-MS法)^[19-21]：肽-N-聚糖酶F切断N-糖链与蛋白链之间的糖肽键，用肽-N-聚糖酶F对糖链切除前后，糖蛋白的分子质量发生变化，在MALDI-TOF-MS上，其质量的差值为N-糖链的长度，N-糖链在整个糖蛋白中的含量为N-糖含量。质谱图中分子离子峰的质量数为[M+H]+，将其减1即为分子质量，酶切前后的分子质量差值为糖链长度，糖含量=[糖链长度/糖蛋白分子质量]×100%。

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讨论

酸水解法分析蛋白质的氨基酸组成是氨基酸分析中最常用的方法。该方法除了使色氨酸遭到破坏，不能被检测以外，其余17种L-型氨基酸均能得到测定分析，其中它括谷氨酰胺水解为谷氨酸，天冬酰胺水解为天门冬氨酸。
(1)常用的酸水解方法是采用5.7 mol/L盐酸真空状态下110 ℃水解24 h或150 ℃快速水解90 min。因为长时间高温水解会破坏含羟基的氨基酸如丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸，因此在不影响水解效果的前提下，应尽量降低水解温度和缩短水解时间。由于半胱氨酸和甲硫氨酸具有还原性，易被空气中残留的微量氧气氧化，因此加入10 g/L苯酚作为抗氧剂。
(2)氨基酸测定方法可分为柱前衍生法和柱后衍生法。柱前衍生法是将氨基酸与衍生化试剂先反应生成氨基酸衍生物，然后用色谱柱进行分离，通过紫外或荧光检测器可直接检测衍生物的光吸收或荧光发射，具有灵敏度高，可用HPLC进行分析等优点。目前常用的柱前衍生试剂有邻苯二甲醛(OPA)和异硫氰酸苯酯(PITC)。PITC具有可与伯胺、仲胺反应，衍生物稳定等优点，被应用于硫酸卡那霉素及其注射液的测定。香菇多糖-十八氨基酸口服液中氨基酸的含量测定及体液游离氨基酸的测定等。本文采用PITC柱前衍生法测定样品水解物中的游离氨基酸，各种氨基酸能达到较好的分离，分离度均大于1.5，检测灵敏度可达到5 pmol左右，并具有良好的线性范围，衍生物稳定。
(3)氨基酸的测定可采用内标法和外标法。内标法可消除操作带来的实验误差，提高结果的准确性和重现性。其中PITC柱前衍生法常用的内标物有a-氨基丁醇、蛋氨酸砜、己氨酸等。本文采用正亮氨酸为内标物，内标物的保留时间在亮氨酸与苯丙氨酸之间，并且能与这两个氨基酸分开，保证了测定结果的稳定性。
(4)采用酸水解法，对色氨酸的破坏较严重，测定值与理论值的偏差为73%。因此要测定色氨酸的组成，可参考文献采用在酸水解中加添加剂如巯基乙酸、B-巯基乙醇或用氢氧化钠和氢氧化钡的碱水解法，另外3 mol/L巯基乙磺酸或4 mol/L甲磺酸在水解时对色氨酸有一定的保护作用。
从3种蛋白样品氨基酸组成分析结果看，Asp+Asn(属酸性氨基酸)的含量最高，EWD1蛋白样品中占12.10%，EWD2蛋白样品中占12.90%，这与双向电泳结果显示3种蛋白的等电点在酸性端相一致[1]。EWD2蛋白样品中Leu氨基酸含量较高，占9.99%，这与EWD2 N端测序结果也相一致(EWD2蛋白样品N端9个氨基酸序列中，Leu占到2个)。另外，从氨基酸组成分析图谱中发现，3种蛋白的谱图中，在A和P之间都存在一个非氨基酸的峰，考虑可能为氨基酸存在修饰或氨基酸上连有糖链。
Edman降解法是目前用于顺序分析的最主要的方法。它的原理是从N端开始，逐步降解。将肽先与PITC在pH 8.0-9.0条件下作用，肽的氨基末端接到异硫氰酸苯酯的C原子上生成苯异硫甲氨酰肽，简称PTC肽，在强酸作用下，可使靠近PTC基的氨基酸环化，肽键断裂形成苯氨基噻唑啉酮衍生物和一个失去末端氨基酸的肽链。此肽不被破坏，因而又可出现一个新的N-末端。重复以上的步骤，继续与PITC作用，继续分析，苯氨基噻唑啉酮衍生物很容易由有机溶剂抽提出来进行鉴定。但此衍生物很不稳定，在水中可转化为稳定的乙内酰苯硫脲氨基酸。这些步骤通常称为Edman氏逐步降解法。所以可用来测定氨基酸的排列顺序。Edman降解法的优点是样品用量少，灵敏度高。Edman降解法得到的氨基酸序列可以为后面克隆cDNA序列提供依据，是很重要的结构研究的内容。
液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)的结果，得到2种蛋白的部分氨基酸序列，与数据库进行同源性比较，提示本实验纯化的2种蛋白均为新蛋白。质谱测定还提供了蛋白的二硫键信息和糖链的信息，为后面的进一步研究提供了基础。
在真核细胞中，有一半以上的蛋白质被糖基化^[24] 。所有生物的细胞表面都由很多不同类型的糖链所包被，并且细胞内也存在各种类型的糖基化；蛋白质糖基化在蛋白质折叠、蛋白质定位和转运、蛋白质溶解性、抗原性以及细胞与细胞的相互作用等方面都有着重要的作用。已知糖基化作用是溶酶体蛋白转运的一个组成部分，甘露糖-6-磷酸是可溶性蛋白转运进入溶酶体的识别信号。对糖蛋白类酶的突变体的研究表明，失去了一个或多个不同的糖基化位点，对形成有活性的酶影响最大。多个糖基化位点突变而只保留一个位点，表达不出有活性的酶，提示多个位点同时糖基化，对酶的转运和活性的形成是必需的，可能是作为溶酶体的定位信号。

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